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          免疫熒光實(shí)驗(yàn)iPSC-derive神經(jīng)元的體外神經(jīng)毒性檢測

          更新時(shí)間:2016-06-16   更新時(shí)間:2016-06-16   點(diǎn)擊次數(shù):4669次

          如今神經(jīng)毒性檢測主要是依賴活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn),不僅有倫理問題,而且通常非常昂貴并且十分耗時(shí)。當(dāng)需要大規(guī)模的測試化合物的時(shí)候就不太合適了。因此,高通量的體外的神經(jīng)毒性測試就顯得十分必要了,而且可以使用人源的細(xì)胞直接進(jìn)行試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果的實(shí)用性也更佳。但是,到目前為止,人源干細(xì)胞誘導(dǎo)的神經(jīng)元并沒有適合進(jìn)行這類試驗(yàn)的特質(zhì),試驗(yàn)時(shí)間較長,批次間差異大,并且有收到倫理和一些法律的制約,使得這種細(xì)胞都不太適用于做大規(guī)模的體外測試試驗(yàn)。近,市面上出現(xiàn)了商用的人源iPSC-derive神經(jīng)元細(xì)胞,重復(fù)性好,可以用來做這類的體外神經(jīng)毒性試驗(yàn)。

          荷蘭的科學(xué)家使用人源iPSC-derive神經(jīng)元細(xì)胞做了免疫熒光染色試驗(yàn),作為高通量進(jìn)行體外的神經(jīng)細(xì)胞毒性檢測的預(yù)試驗(yàn)。由不同供應(yīng)商提供的人源iPSC-derive神經(jīng)元細(xì)胞混合培養(yǎng)能夠形成不同(激活型或抑制型)神經(jīng)元共培養(yǎng)的樣本。

           

          ALTEX. 2016 Mar 24. doi: 10.14573/altex.1510091

          Is the time right for in vitro neurotoxicity testing using human iPSC-derived neurons?

          Tukker AM1, de Groot MW1, Wijnolts FM1, Kasteel EE1, Hondebrink L2, Westerink RH1.

           

          一、實(shí)驗(yàn)材料

          1)細(xì)胞: iCell® Neurons (NRC-100-010-001,Cellular Dynamics international)

                    CDI iCell® Astrocytes(Cellular Dynamics international)

                    HIP neurons (GSC-4312, MTI-GlobalStem)

                    DOPA.4U® neurons (Axiogenesis, Cologne, Germany)    

          2)培養(yǎng)基:Complete iCell Neurons Maintenance Medium (with 2% iCell Neurons Medium Supplement) supplemented with laminin (10 μg/mL)

          3)試劑: Poly-L-Ornithine ([PLO] 0.01%)

          4)培養(yǎng)耗材:µ-Slide 8孔腔室載玻片,ibiTreat底部處理 (ibidi,Germany,80826)

           

          二、實(shí)驗(yàn)方法

          一)載玻片包被

          ① 每孔加入300μl 的  0.01%的Poly-L-Ornithine 溶液

          ② 室溫孵育60分鐘

          ③ 吸除所有液體并小心用PBS沖洗5-10分鐘,即可開始使用

          二)免疫熒光實(shí)驗(yàn)

          1)鋪細(xì)胞:

          iCell® Neurons 每孔鋪100000個(gè)細(xì)胞

          iCell® Neurons/CDI iCell® Astrocytes共培養(yǎng),每孔鋪66000個(gè)細(xì)胞

          HIP neurons 每孔鋪100000個(gè)細(xì)胞

          DOPA.4U® neurons 每孔鋪52000個(gè)細(xì)胞

          DOPA.4U® neurons/iCell® Astrocytes共培養(yǎng),每孔鋪48000個(gè)細(xì)胞

           

          2)加入約300μl/孔的4%多聚甲醛的PBS溶液,靜置15分鐘

          3)加入300μl 1% Triton® X-100 的PBS 溶液通透3-5分鐘

          4)加入300μl 2% BSA的PBS溶液封閉20分鐘

          5)依次加入一抗,二抗進(jìn)行免疫熒光染色后,沖洗小室并加入封片液進(jìn)行顯微鏡觀察(圖二)。

           

          圖二:圖示鋪細(xì)胞,固定,清洗,染色步驟。

           

          三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

           

           

          圖三:iPSC-derive神經(jīng)元的免疫熒光染色結(jié)果。不同種類的人源iPSC-derive神經(jīng)元使用β(III)tubulin(綠色)和GFAP(紅色),用來區(qū)分神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞(HIP® neurons, 左上;DOPA.4U® neurons,左下;iCell neurons,右上。) Human iCell 神經(jīng)元用vGAT (綠色) 和vGluT (紅色)確定抑制或激活突觸(右下)。細(xì)胞核使用DAPI染色(藍(lán)色)。

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